En patch clamp inspelning avslöjar övergångar mellan två ledningsförmåga läge av en endaste jonkanal: Stängt samt öppna.

Patch clamp-tekniken är en laboratorieteknik i elektrofysiologi som tillåter studiet utav enkla alternativt multipla jonkanaler i celler.
Tekniken kan tillämpas på ett enormt antal annorlunda celler, men är särskilt användbar i studiet utav exciterbara celler såsom neuroner, kardiomyocyter, muskelfibrer samt pankreasceller beta.
Men kan oxå begagnas för att studera av bakteriella jonkanaler i i synnerhet framställda jätte sfäroplaster.

Plåster clamp tekniken är en vidareutveckling utav spänningsklämman.

Erwin Neher samt Bert Sakmann utvecklade patch clamp i slutet utav 1970 och början utav 1980-talet.
Denna upptäckt gjorde det möjligt att spela in strömmarna utav enstaka jonkanaler för första gången, visar deras deltagande i grundläggande cellprocesser såsom aktionspotential ledning.
Neher och Sakmann fick Nobelpriset i fysiologi eller medicin 1991 för detta arbete.

Grundläggande princip Cellanslutna patch clamp nyttjar en mikropipett fäst till cellmembranet för tagning från en endaste jonkanal.

Patch clamp tagning används, som en elektrod, en glasmikropipett som har en öppen spets diameter av ca en mikrometer, en dimension innesluter ett område membranyta eller “lapp” som ofta består av bara en alternativt ett fåtal molekyler jon kanaler.

Denna typ utav elektrod är skild från den “skarpa mikroelektroden” som används för att spetsa celler i traditionella intracellulära inspelningar, i det att den förseglats på ytan av cellmembranet, snarare än infört igenom den.
I somliga experiment, är mikropipett spetsen het i en microforge att producera en jämn area som hjälper att alstra en hög motstånd tätning med cellmembranet.

Det invärtes utav pipetten är fylld med en lösning som passar den joniska sammansättningen utav badlösningen, som i fallet utav cell-anslutna inspelning, alternativt cytoplasman för helcells-inspelning.

En klorerad silvertråd placeras i kontakt med denna lösning, och leder ström till förstärkaren.
Utredaren kan ändra sammansättningen av denna lösning eller placera droger för att studera jonkanalerna under olika förhållanden.
Mikropipetten pressas mot ett cellmembran och sug appliceras för att främja bildandet utav en hög motstånd tätning mellan glaset samt cellmembranet (en “gigaohm sigill” eller “gigatätning”, eftersom det elektriska motståndet hos denna tätning är över en gigaohm).

Den höga resistansen hos denna tätning gör det möjligt att elektroniskt isolera de strömmar som mäts över membranplåstret med lite konkurrerande distraktion, därtill att ge en speciell mekanisk fasthet till inspelningen.
Till skillnad från traditionella två-elektrod inspelningar med spänningsklämma använder patch clamp tagning en endaste elektrod för att spela in strömmarna.

Många patch clamp förstärkare använder inte spänningsklämma utan är differentiella förstärkare som nyttjar badelektroden för att nollställa nuvarande nivå.
Detta kan forskaren att hålla spänningen beständig under iakttagande av förändringar i el.
Eller kan cellen vara aktuellt fastklämd i helcells-läge, håller strömmen konstant samtidigt iaktta förändringar i membran spänning.

Variationer

Flera variationer av den grundläggande tekniken kan nyttjas, avhängig på vad forskaren vill studera.
De Inifrån-ut samt utanför ut tekniker heter “utskurna patch”-teknik, eftersom plåstret skärs (bort) från huvuddelen av cellen.

Cell-bunden och bägge utskurna patch tekniker används för att studera beteendet hos enskilda jonkanaler i den andel av membranet som är fäst till elektroden.

Helcell-lapp samt perforerade plåster tillåter forskaren att studera elektriska beteende i hela cellen, i stället för enkanaliga strömmar.
Hel-cell plåster, som möjliggör låg resistans elektrisk access till insidan utav en cell, har idag till enorm del ersatt utav hög motstånd tekniker mikroelektrod tagning för att spela in strömmar över hela cellmembranet.

Vid denna volymetriska analysövningen kommer vi att begagna en 25 ml volymetrisk pipett.

En lärare innehar producerat denna övning samt är alltid gärna att låna ut en hand, han kommer att vara vår demonstrator för en korrekt användning av en volymetrisk pipett.

Välj ut en 25 ml pipett och drilla ett par gånger med destillerat vatten innan du nyttjar den för att dra i samtliga reagenser.

Det är alltid en bra förslag att undersöka var pipett man tar ur lådan eftersom man alltemellanåt kan finna en ”fripassagerare” som kom i samt kunde ej komma ut.

Det är ofta enkelt att hitta en som fastnade för länge efter, kanske redan på fjortonhundratalet.

Vi skulle vet ej hur gammal den är utan att främst göra några C-14 datering på den.

Man bör också undersöka tippen för fraktur.

Flera småskador är triviala.

Det är de visar mindre chipping runt kanten på spetsen, men här är en där hela väggen har brutits vid en punkt. Man kan blott knappt se den intakta munstycket, men en sådan pipett är oanvändbar alldenstund vätskevägen innehar äventyrats.

Bäst att dumpa den.

Man kommer att använda en av ett par typer utav suganordningar att fylla pipetten.

Om suganordningen är en gummiblåsa, bör den inte vara ligga så att den är ansluten till mynningen av pipett.

Det skall i stället att pressas så att hålet för blåsan gör en lufttät tätning mot mynningen på pipetten.

Observera att man ska klämma ihop blåsan före man tryckter den mot munnen av pipetten.

Spetsen på pipett kan sedan placeras i lösningen som ska upprättas och blåsan frigöras maklig.

Denna metod kräver en del träning, men i slutändan kan vara betydligt mer praktiskt och tillfredsställande än att använda den högteknologiska pipettsystemet som vi skall titta på i nästa exercis, med Eppendorf pipett.

Man måste bedriva noga med att ej bevilja spetsen på pipetten för att bryta ytan utav vätskan medan man drar ut utav lösningen eller en plötslig minskning i viskositet vid spetsen.

Detta kommer att orsaka en enorm antal fluid förorenar insidan utav din gummikolv på grund av inträde utav luft kommer att avfyra vätskan uppåt bortom mynningen på pipetten.

Dra opp lösningen tills menisken är flera centimeter ovan kalibreringskurvan, fason efter att snabbt fingret över det starta hålet i pipetten.

Se till att din siktlinje är vinkelrät mot längden på pipetten och tillåta en liten antal luft i så att menisken sjunker till märket.

När botten av menisken sammanfaller med märket, består av din pipett en exakt uppmätt volym.

Pipetten kan efter att tas bort från reagenslösning, överföras till den mottagande kolven och tillåtas dräneras.

En volymetrisk pipett skall ej “blåses ut” för att mata ut all fluid vid spetsen alldenstund volymetriska pipetter kalibreras på ett sätt som tar aktsamhet till den lösning som förblir i spetsen på grund av ytspänningen.